在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，大部分實(shí)驗(yàn)只需要用到相關(guān)細(xì)胞系的培養(yǎng)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原代細(xì)胞的培養(yǎng)也是非常重要的。脾臟T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)就是免疫學(xué)領(lǐng)域的一種非常基礎(chǔ)和重要實(shí)驗(yàn)方法。本文將詳細(xì)探討小鼠脾臟T細(xì)胞分離培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟，幫助大家更有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

提取小鼠脾臟的naive CD4+ T細(xì)胞，研究某種因素對(duì)naive CD4+ T細(xì)胞或某一亞型的CD4+ T細(xì)胞增殖分化和功能狀態(tài)的影響，或者在誘導(dǎo)分化為CD4+ T細(xì)胞的某一亞型后做下游實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

小鼠脾臟naive CD4+ T細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

三、實(shí)驗(yàn)條件

動(dòng)物房超凈臺(tái)、細(xì)胞房超凈臺(tái)

四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)菌分選是關(guān)鍵。磁珠分選（MACS）和流式分選（FACS）是最經(jīng)常使用的兩種分離特定細(xì)胞的方法。

流式分選可以有以下特點(diǎn)：

1.實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的分選

2.同時(shí)分選多種細(xì)胞

3.可以基于細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)水平進(jìn)行分選

4.可以基于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物進(jìn)行分選

5.可以分選由多個(gè)標(biāo)志物復(fù)雜組合的細(xì)胞類型

磁珠分選是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗結(jié)合，在外界磁場(chǎng)中與抗體結(jié)合的細(xì)胞被吸附而滯留在分選柱內(nèi)，而缺乏該表面抗原的細(xì)胞則不能在分選柱內(nèi)停留。分為陽(yáng)性分選（磁珠結(jié)合的細(xì)胞是目的細(xì)胞）和陰性分選（磁珠結(jié)合的細(xì)胞是非目的細(xì)胞）兩種分選策略。

與流式分選相比，磁珠分選更簡(jiǎn)便更快捷，是分離常見(jiàn)細(xì)胞類型的第一選擇。在樣本量較大或分選稀有細(xì)胞類型時(shí)，先磁珠分選后流式分選的方案能夠顯著提高分選的效率。

五、實(shí)驗(yàn)材料

（一）10cm培養(yǎng)皿、PBS、75%酒精、24孔板、手術(shù)器械（兩套）

（二）STEMCELL磁珠分選儀器、磁珠分選磁力架、分選柱、70um細(xì)胞濾網(wǎng)、裂紅液

六、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）取脾（動(dòng)物房超凈臺(tái)）

1.將小鼠脫頸處死，用75%酒精浸泡一分鐘后放入10cm培養(yǎng)皿中準(zhǔn)備解剖，使用不同的小鼠品系可能會(huì)影響產(chǎn)量和性能。例如，來(lái)自C57BL/6小鼠的細(xì)胞更好地產(chǎn)生Th1細(xì)胞，而來(lái)自Balb.c小鼠的細(xì)胞更好地產(chǎn)生Th2細(xì)胞。；

2.第一套器械用于剪開(kāi)分離皮膚肌肉，暴露出足夠的視野時(shí)，換用第二套器械用于取脾。之后處理每一只小鼠時(shí)，第一套和第二套器械都不要混用；

3.取出的脾放入裝著PBS的24孔板中。

（二）制備單細(xì)胞懸液（細(xì)胞房超凈臺(tái)）

1.將脾臟放在70um細(xì)胞濾網(wǎng)上，研磨并加入5ml PBS（一個(gè)脾臟用5ml）過(guò)濾，過(guò)濾至15ml/50ml離心管中，這一步建議過(guò)濾兩次，否則會(huì)在后續(xù)離心時(shí)形成富含纖維的沉淀，棄置此沉淀又會(huì)浪費(fèi)很多細(xì)胞；

2.600g離心5min，棄上清。每個(gè)脾臟5ml/10ml裂紅液重懸，室溫裂紅5min，加入2ml/4ml PBS（與裂紅液體積對(duì)應(yīng)）終止；

3.600g離心5min，棄上清。每管脾臟取1-2ml PBS重懸，從中取出100ul依次稀釋成10倍和100倍；

4.從10倍和100倍稀釋液中取出10ul放入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（三）磁珠陽(yáng)性分選（細(xì)胞房超凈臺(tái)）

磁珠分選大致分為三個(gè)步驟：潤(rùn)洗（用分選buffer潤(rùn)洗分選柱）、過(guò)濾（多次重復(fù)過(guò)濾細(xì)胞懸液）、洗滌（用分選buffer洗滌柱子，使細(xì)胞洗脫）。

（四）T細(xì)胞分化培養(yǎng)基制備（細(xì)胞房超凈臺(tái)）

1.磁珠分選前一天（也就是Day0）準(zhǔn)備培養(yǎng)板，加入250ul anti-mouse CD3（2 µg/mL或3 µg/mL，用PBS稀釋），37℃孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜包被。

2.配置T細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（50ml）：48.5ml的1640（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基、0.5ml HEPES、0.5ml GlutaMAX、0.5ml丙酮酸鈉、50ul 2-ME；

3.重懸分裝各類細(xì)胞因子，最終濃度為10ug/ml，于-20℃保存；

4.配置各種分化培養(yǎng)基（用24孔板進(jìn)行分化培養(yǎng)，每個(gè)孔加入1ml培養(yǎng)基）

（1）Th1：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，10ul IL-12，10.3ul IL-4抗體；

（2）Th2：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，10ul IL-4，11.5ul IFN抗體；

（3）Treg：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，10ul TGF-β；

（4）Th17：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，2ul TGF-β，20ul IL-6，10ul IL-1β，10.3ul IL-4抗體，11.5ul IFN抗體；

（以上培養(yǎng)基在4℃僅能保存一周）

5.每1ml細(xì)胞懸液（10^6個(gè)細(xì)胞）加入25ul CD3/CD28磁珠，振蕩混勻。不論任何分化體系都需要有CD3/CD28/IL-2的參與，這3者是T細(xì)胞增殖的基本功能抗體和細(xì)胞因子；

6.將分選出的naive CD4+ T細(xì)胞離心，按照你想要研究的亞型分成不同部分，用各自的分化培養(yǎng)基重懸，以10^6個(gè)細(xì)胞/1ml加到24孔板中培養(yǎng)

7.Day2.3 僅觀察；Day 4 直接在原孔中補(bǔ)充分化培養(yǎng)基；Day5 僅觀察；Day6 收取細(xì)胞，通過(guò)流式檢測(cè)分泌的細(xì)胞因子的水平，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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