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【外泌體應(yīng)用】天然納米藥物載體
發(fā)布時間： 2021-10-08 點擊次數(shù)： 4798次外泌體是來源于細(xì)胞內(nèi)膜的30-180 nm的脂質(zhì)雙層包裹的囊泡，包含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生命物質(zhì)，在細(xì)胞外環(huán)境中循環(huán)，是細(xì)胞間通訊工具。外泌體在形成的過程中，會把一些蛋白質(zhì)、活性酶囊括在內(nèi)以及攜帶一系列的寡核苷酸，特別是線粒體DNA，mRNA，miRNA和許多其它非編碼RNA等。因而外泌體是天然的多功能載體，可以包裹并遞送各種生命物質(zhì)，例如小RNA、mRNA和蛋白質(zhì)等。相對于脂質(zhì)體和病毒載體，外泌體穩(wěn)定性高，生物相容性好，免疫原性低，而且可以滲透生物屏障（例如血腦屏障、胎盤屏障），故外泌體作為天然納米型藥物遞送載體有著巨大應(yīng)用前景。
外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢
生物來源的外泌體作為載體，具備良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，穩(wěn)定性以及低免疫原性。 首先，外泌體是納米級囊泡，具有穩(wěn)定的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可以裝載大量的水溶性物質(zhì)。其次，外泌體表面有很多跨膜蛋白，在結(jié)構(gòu)上還具有可改造性，通過基因修飾，實現(xiàn)體內(nèi)靶向治療。此外，外泌體自身具有細(xì)胞選擇性與組織特異趨向性，可以通過血腦屏障和穿透致密結(jié)構(gòu)組織。而且在治療上，外泌體載體還有易于注射和防止血管堵塞的特點?？偠灾?，天然的外泌體在藥物遞送和疾病治療有著巨大的潛力。
外泌體加載藥物的方式
1、外泌體直接加載藥物 電穿孔法是將藥物加載到外泌體中比較成熟的方法。電穿孔法的原理是將外泌體和藥物懸浮液暴露在電場中，外泌體膜上短暫的高壓脈沖下會產(chǎn)生無數(shù)的孔，藥物小分子則滲透到外泌體中。電穿孔方法簡單且省時，但高壓脈沖會使外泌體聚集，降低藥物加載效率。
除了電穿孔法外，還有其他方法將藥物加載到外泌體，如藥物和外泌體直接混合，超聲處理，轉(zhuǎn)染試劑等。超聲處理是一種應(yīng)用超聲波將藥物加載入外泌體的方法，具有高載藥效率和持續(xù)藥物釋放的優(yōu)點。
2、外泌體分泌前加載藥物 藥物與細(xì)胞一起孵育的方式，可以將藥物通過分泌外泌體釋放到培養(yǎng)基。即先將藥物載入到源細(xì)胞中，通過分離純化獲得載藥外泌體。另外還有比較常用的一種方法是轉(zhuǎn)染，即將小分子RNA轉(zhuǎn)染至源細(xì)胞。
間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因其在腫瘤微環(huán)境中的定位能力而被應(yīng)用于輸送抗癌藥物。Pascucci等發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫杉醇（PTX）誘導(dǎo)后，骨髓MSCs分泌的外泌體載有紫杉醇，通過超速離心將外泌體分離出來，研究其對人胰腺癌細(xì)胞株的影響，結(jié)果表明負(fù)載紫杉醇的MSCs分泌的外泌體含大量紫杉醇，具有較強的抗腫瘤活性。
外泌體遞送的藥物類型
外泌體最大的特性之一是它們穿過屏障（如細(xì)胞質(zhì)膜和血腦屏障）的能力，作為藥物遞送載體具有很大潛力，適用于遞送各種化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和基因治療劑。
1、外泌體作為小分子藥物遞送載體 腫瘤治療需要低免疫原性和低毒性的靶向藥物載體。2013年Tian等發(fā)表在Biomaterials的文章通過電穿孔將化療藥物如阿霉素（Dox）加載到iRGD肽功能化的外泌體，輸送到BALB/c裸鼠的腫瘤組織中。為了降低免疫原性和毒性，使用小鼠未成熟樹突狀細(xì)胞（IMDC）產(chǎn)生外泌體。通過工程化IMDC以表達(dá)與αv整合素特異性iRGD肽融合的外泌體膜蛋白（Lamp2b），具有腫瘤靶向性。從IMDC純化的外泌體通過電穿孔加載Dox，加載率高達(dá)20%。靜脈注射靶向性外泌體將Dox特異性地輸送到腫瘤組織，抑制腫瘤生長而無明顯毒性。
熒光共聚焦成像，iRGD-Exos在細(xì)胞內(nèi)遞送Dox藥物
2、外泌體作為CRISPR-Cas9質(zhì)粒的載體 CRISPR/Cas9是一種很有前途的基因編輯技術(shù)。迄今為止，CRISPR/Cas9的細(xì)胞內(nèi)運載體受到免疫原性、運載容量和低耐受性等問題的限制。McAndrews等在今年的Life Sci Alliance期刊發(fā)表文章，報告了一種基于工程外泌體的CRISPR/Cas9非病毒遞送系統(tǒng)。
文章表明，非自體外泌體可以通過常用的轉(zhuǎn)染試劑包封CRISPR/Cas9質(zhì)粒DNA，并且可以運送到受體癌細(xì)胞以誘導(dǎo)靶向基因缺失。在胰腺癌的原位模型中，裝載CRISPR/Cas9的外泌體可以靶向胰腺癌細(xì)胞中的突變Kras G12D致癌等位基因，從而抑制癌細(xì)胞增殖和生長。外泌體是CRISPR/Cas9基因編輯靶向治療的一個潛在遞送系統(tǒng)。
3、外泌體作為核酸藥物遞送載體
外泌體包含miRNA、siRNA、mRNA等，說明外泌體具有對核酸藥物的天然包容性。外泌體可以攜帶遺傳基因（例如miRNA，siRNA）到靶細(xì)胞中，從而在生物學(xué)和致病過程中誘導(dǎo)遺傳修飾。外泌體的這種特征受到了基因治療的青睞。
2011年Alvarez-Erviti等發(fā)表在Nat Biotechnol上文章，研究外泌體將siRNA遞送到小鼠大腦。為了降低免疫原性，作者使用自體樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體，通過樹突狀細(xì)胞表達(dá)外泌體膜蛋白Lamp2b，融合到神經(jīng)元特異性RVG肽，實現(xiàn)了靶向。利用電穿孔法將純化的外泌體加載外源性siRNA。靜脈注射靶向外泌體將siRNA特異性傳遞給大腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞。
結(jié)果表明，在治療阿爾茨海默病的小鼠模型中，外泌體可以作為siRNA向大腦遞送的有效載體。
靶向外泌體基因遞送的給藥示意圖
Naseri等利用從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分離的外泌體（MSCs-Exo）來遞送LNA（locked nucleic acid）修飾的抗miR-142-3p寡核苷酸，以抑制4T1和TUBO乳腺癌細(xì)胞系中miR-142-3p和miR-150的表達(dá)水平。體外實驗結(jié)果表明，MSCs-Exo能有效地遞送抗miR-142-3p，降低miR-142-3p和miR-150水平。作者還評估了MSCs-Exo在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，MSCs-Exo可以穿透腫瘤部位，將抑制性寡核苷酸導(dǎo)入腫瘤組織，從而下調(diào)miR-142-3p和miR-150的表達(dá)水平。MSCs來源外泌體可以作為可行的納米載體遞送RNA藥物分子。
MSCs-Exo在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布
4、外泌體作為蛋白質(zhì)的藥物遞送載體
蛋白質(zhì)藥物相對于基因藥物更直接，但是直接進入生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)藥物容易引起免疫反應(yīng)而被清除。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體可遞送多種蛋白質(zhì)，如酶、細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)和跨膜蛋白質(zhì)等。
Yim等2016年發(fā)表文章使用光誘導(dǎo)外泌體加載治療蛋白，使用藍(lán)光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和內(nèi)源性外泌體發(fā)生過程，將蛋白質(zhì)裝載到外泌體中。該研究小組將蛋白治療劑與感光色素蛋白2（CRY2）相結(jié)合，外泌體與螺旋-環(huán)-螺旋（CIBN）相結(jié)合，然后用450~490 nm波長的藍(lán)光照射，此時蛋白質(zhì)治療劑和外泌體將會結(jié)合在一起。結(jié)果表明，該技術(shù)可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)治療劑到達(dá)靶細(xì)胞，是一種高效的外源蛋白質(zhì)裝載方法，可以作為一種有效的將蛋白治療藥物載入到受體細(xì)胞和組織的方法。
藍(lán)光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和內(nèi)源性外泌體發(fā)生過程示意圖
Nature Biotechnology雜志去年發(fā)表文章，報道了多家大型制藥公司如禮來、武田、拜耳等押注外泌體和其他細(xì)胞外囊泡，作為治療藥物遞送的一種手段。Aruna Bio公司于2019年7月完成1300萬美元的融資，用于支持神經(jīng)外泌體遞送平臺的持續(xù)開發(fā)和新型神經(jīng)外泌體療法的推進?？偛课挥谟＝虻?Evox Therapeutics 于2017年12月宣布與勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）進行合作，研究外泌體介導(dǎo)與RNAs藥物遞送，并于2018年9月獲得3550萬英鎊的B輪融資。
盡管外泌體作為藥物載體是一個熱門研究方向，但現(xiàn)階段還有技術(shù)問題有待解決。其一是大規(guī)模高效生產(chǎn)（【外泌體研究】FiberCell為您富集高濃度的外泌體），還有就是外泌體的純化純化技術(shù)，對于大規(guī)模外泌體的純化目前還沒有很好的解決方案，這是目前外泌體應(yīng)用上所面臨的重大挑戰(zhàn)。
參考文獻： Pascucci L, Coccè V, Bonomi A, et al. Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibit in vitro tumor growth: a new approach for drug delivery. J Control Release. 2014;192:262-270.
Tian Y, Li S, Song J, et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 2014;35(7):2383-2390.
McAndrews KM, Xiao F, Chronopoulos A, et al. Exosome-mediated delivery of CRISPR/Cas9 for targeting of oncogenic KrasG12D in pancreatic cancer. Life Sci Alliance. 2021;4(9):e202000875.
Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H,et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011;29(4):341-345.
Naseri Z, Oskuee RK, Jaafari MR, Forouzandeh Moghadam M. Exosome-mediated delivery of functionally active miRNA-142-3p inhibitor reduces tumorigenicity of breast cancer in vitro and in vivo. Int J Nanomedicine. 2018;13:7727-7747.
Yim N, Ryu SW, Choi K, et al. Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically reversible protein-protein interaction module. Nat Commun. 2016;7:12277.
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