IHC 常見的 8 大疑問

Q1：冰凍切片和石蠟切片如何取材？ 

Answer: 冰凍切片取材可分為兩種情況：1）動物灌流固定：如小鼠心臟灌流，首先采用預冷的 1×PBS 灌流沖洗直至血液全部放出，隨后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直，而后解剖獲取組織，于 4℃、4%PFA 中固定 1h 左右，1×PBS 洗 5 次（30min/次），25%蔗糖溶液脫水 12h 左右包埋即可。 2）直接取材：直接選擇新鮮組織進行冰凍切片，此時不需要進行抗原修復。缺點：切出的片子含水量會比較多，形成冰晶影響結果，而且后期的丙酮固定也會改變細胞的形態(tài)。石蠟切片：動物組織取材（灌流與否都可以，并不影響后續(xù)的操作）后，置于 10%福爾馬林溶液中固定 3-4 天后，脫水，包埋，即可進行石蠟切片操作。 

Q2:石蠟切片和冰凍切片的區(qū)別比較 

Answer: 1）石蠟切片制備過程較復雜，抗原活性差，但切片薄（3-5μm），便于觀察細胞的細微結構，且常溫保存即可，非常方便。2）冰凍切片較厚（8-12μm），操作簡單，抗原活性好， 但是保存時間短，且一定放在-80℃的低溫冰箱中。

Q3：一抗的選擇要點是什么？ 

Answer：1）一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對低；而多克隆抗體特異性弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可通過封閉來避免）。2）抗體的比例可依據(jù)抗體說明書或 western blot 的抗體比例來做即可。3）對于組織樣本，一般要在 37℃孵育 1-2h 或 4℃冰箱孵育過夜（效果較為佳，且拿出后需 37℃復溫 45min），并保持濕盒里的濕度來防止抗體蒸發(fā)。對于難以著色的，在第二天還需將濕盒置于室溫孵育。

Q4：如何選擇封閉血清？ 

Answer：封閉血清一般是和二抗同一來源，可封閉非特異性結合位點，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗的來源一致。

Q5：DAB 顯色時間如何把握？ 

Answer：可選擇一張陽性的片子，用計時器精確計時在顯微鏡下判斷出具體時間后，再對所有片子進行顯色，采用相同的時間來界定。一般如果抗體濃度適宜，操作無誤，10 分鐘內(nèi)肯定能夠顯色，如果超過該時間，說明一抗比例不夠或者封閉太久等等原因。顯色時間越短，則說明抗體濃度高或抗體孵育時間過長，需下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時間。

Q6：IHC 復染時間的選擇？ 

Answer：蘇木素復染時間一般為 5min 左右，可調(diào)整，染色時間太淺，可延長時間，反之縮短時間；隨后進行鹽酸酒精分化，數(shù)秒即可，自來水洗，最后置于氨水中返藍。

Q7：免疫組化的結果如何分析？ 

Answer：1）必設對照組。如陰性、陽性及自身對照。

由表中可知，只有 6、7 實驗結果有意義。1-5 均因對照組的結果已否定抗體的特異性或因 ICH 技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，則必須重復實驗或換用抗體。 2）陽性著色細胞計數(shù)法。在 40 倍光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組 3-6 張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。 3）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。 4）分級法。免疫組化的半定量一般分為三級：弱（+），中（++），強（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強（+++）=3。至少隨機觀察 5-10 個 HPF。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計算出數(shù)值；總數(shù)值<1.0 者為（+），1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)。

Q8：IHC 常見的疑難雜癥有哪些？ 

Answer：