RNAi 技術(shù)的前世今生 

造物真的很神奇。生物體有很多機會被來自病毒、細菌等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)。但宿主會說，“你有張良計我有過墻梯"，這個過墻梯就是 RNAi：宿主細胞會對這些外源性基因 dsRNA 隨即產(chǎn)生反應，被核酸內(nèi)切酶 Dicer 切割成小片段 RNA（即 siRNA）。siRNA 再與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成 RNA 誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC 與外源性基因表達的 mRNA 進行特異性結(jié)合并將其切割，使得 mRNA 降解。然后 siRNA 還會“乘勝追擊"，可作為引物與靶 RNA 結(jié)合并在 RNA 聚合酶作用下合成更多新的 dsRNA， 新合成的 dsRNA 再由 Dicer 切割產(chǎn)生大量的次級 siRNA，從而使 RNAi 的作用進一步放大，最終將靶 mRNA *降解。

在 RNAi 感染過程中,產(chǎn)生 dsRNA 的一個有效方法就是在體內(nèi)表達一個短發(fā)夾 RNA 分子,這種 shRNA 包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補),中間由一個 loop 序列分隔,組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi) shRNA 可以被加工 siRNA。

傳統(tǒng) shRNA 脫靶作用大且抑制 miRNA

大家都知道，利用生物體的 RNAi 現(xiàn)象發(fā)展出來的 RNAi 技術(shù)是目前最“喜聞樂見"的基因沉默技術(shù)。

在科研中制備 siRNA 的方法主要有化學合成法和轉(zhuǎn)錄法。其中，轉(zhuǎn)錄法，通俗點說就是“借腹生子"。就是通過 DNA 載體，利用細胞內(nèi)源的 RNA 聚合酶Ⅲ（RNA PolⅢ），如 U6、H1 等 的啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄表達 shRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的發(fā)夾狀 shRNA 可以被細胞內(nèi)源的 Dicer 蛋白識別并加工成 siRNA，然后與 Ago 蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。將這些 shRNA 的表達框用質(zhì)粒或者腺病毒等包裝一下轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)，就可以實現(xiàn)在動物整體或特定組織中沉默靶基因。

雖然這項技術(shù)可以實現(xiàn)在動物整體或特定組織中沉默靶基因，但是不可避免的是在這個過程中 siRNA 會“亂來"，比如，偶爾會饑不擇食，慌不擇路地與非特異的 RNA 序列結(jié)合，把人家該正常表達的“無辜"基因沉默掉，這就是所謂的脫靶作用（off-target）。

作為 siRNA 的前身 shRNA 也會瞎搗弄，就是對細胞內(nèi)源 miRNA 的競爭抑制。由于 shRNA 的加工需要細胞內(nèi)的 Dicer、Exportin-5、Ago 等蛋白質(zhì)因子協(xié)助，而這些萬人迷般的蛋白質(zhì)因子也是細胞內(nèi)源 miRNA 加工成熟所必須的。由于 miRNA 是細胞功能的重要調(diào)控分子，過表達的 shRNA 與內(nèi)源 miRNA 競爭相同的加工機器，必然對內(nèi)源 miRNA 的表達和功能造成抑制作用。shRNA 瞎搗弄的后果可以很嚴重，比如在小鼠肝臟中長期高表達 shRNA 會造成嚴重的肝臟損傷并引發(fā)肝癌導致動物死亡。

因此，設(shè)計一種低毒副作用的 RNAi 載體進行高效沉默靶基因很重要。

saiRNA 的*性：高效率、低脫靶 

而吳立剛研究組對具有不同莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 siRNA 前體的加工和功能進行了深入研究，并在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種比傳統(tǒng) shRNA 效率更高，脫靶作用更少的新型 RNAi 載體--saiRNA（singlestrandedAgo2-processed interfering RNA）。 在 RNAi 發(fā)揮基因沉默功能的過程中，RISC 復合物是核心成分，主要由外源提供的 siRNA 與 細胞內(nèi)的 Ago 家族蛋白質(zhì)組裝形成。哺乳動物中其蛋白家族有四成員：Ago1、2、3、4，但 只有 Ago2 是 RNAi 的“真愛"，具有 RNAi 活性（切割*互補配對 RNA 的核酸內(nèi)切酶活性）， 而 Ago1、3、4 沒有 RNAi 活性卻會引起較強的脫靶作用。傳統(tǒng) shRNA 產(chǎn)生的 siRNA“很博愛"， 能與所有 Ago 蛋白結(jié)合不同， 但吳立剛研究組發(fā)明的 saiRNA 只有與 Ago2 結(jié)合后才能被加工產(chǎn)生成熟的 siRNA，因此有效避免了與 Ago1、3、4 介導的脫靶作用，從而顯著增強了其對靶基因的沉默效率。

saiRNA 的“專一"還體現(xiàn)在：與 Ago2 結(jié)合后加工產(chǎn)生成熟的 siRNA，其特殊的加工方式只產(chǎn)生一條導向鏈（guide strand，具有基因沉默功能的 siRNA 鏈），不會產(chǎn)生 passenger strand（與 guide strand 互補配對的沒有基因沉默功能的 siRNA 鏈），因此也就*避免了由 passenger  strand 與 Ago 蛋白結(jié)合后產(chǎn)生的脫靶作用。

saiRNA 的優(yōu)勢還在于對細胞內(nèi)源 miRNA 的影響小。這個邏輯有點繞，就是，不論是化學合成的 saiRNA，還是基于 RNA 聚合酶 III 的 DNA 表達載體在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的 saiRNA，因為 對 Ago2 的專一，其被加工后產(chǎn)生的 siRNA 的單位濃度分子對靶基因的抑制效率都高于傳統(tǒng)的 shRNA。因此，在同樣的沉默效率下，saiRNA 產(chǎn)生的成熟 siRNA 在細胞內(nèi)的積累量要遠低于 shRNA，避免了占用大量 Ago 蛋白，并且其加工不需要 Dicer 等 miRNA 加工所必須的“萬人迷"蛋白質(zhì)因子，因此不會跟細胞內(nèi)源 miRNA 爭搶，更不會對內(nèi)源 miRNA 的表達和功能造成抑制作用。

所以，saiRNA 作為一種新型的 RNAi 載體，具有高效和低脫靶的特點，通過對 saiRNA 設(shè)計的繼續(xù)優(yōu)化，以及動物整體的基因沉默實驗，將為科學研究和基因治療應用提供更為安全高效的工具。